Она была старшей дочерью императора Максимилиана II и его жены Марии Испанской, дочери императора Карла V. Первоначально она также как и третья жена Филиппа II Елизавета Валуа предназначалась в жёны наследнику испанского престола Дону Карлосу, но он неожиданно умер 24 июля 1568 года. В том же году 3 октября умерла и Елизавета Валуа вследствие неудачных родов. Король Филипп II остался таким образом и без жены, и без наследника престола. В 1570 г. Анна прибыла в Мадрид в сопровождении своих братьев Альбрехта и Венцеля, которые остались в Испании, чтобы получить образование при королевском дворе. 12 сентября 1570 года в Сеговии Филипп II женился на Анне. Она доводилась ему племянницей, её мать была родной сестрой короля Испании.

В 1571 г. она родила первенца Фердинанда. Однако из пяти рождённых ею детей только четвертый, Филипп, дожил до совершеннолетия и стал впоследствии королем Испании Филиппом III. В 1580 г. Анна с мужем поехали в Португалию, чтобы заявить свои права на португальский престол после смерти короля Энрике I, не оставившего после себя наследников. Они доехали до Бадахоса, где король серьёзно заболел гриппом. Ухаживая за мужем, Анна тоже заразилась гриппом и умерла в возрасте тридцати лет.